LabPON implementeert Next Generation Sequencing

Simultane mutatieanalyse van een groot aantal moleculaire markers met een minimale hoeveelheid patiëntmateriaal

Snelle ontwikkelingen in de moleculaire pathologie

Het veld van de moleculaire diagnostiek in de pathologie verandert snel en het aantal moleculaire targets met klinische relevantie neemt toe. De verwachting is dat op niet al te lange termijn een veelvoud aan moleculaire markers als basis zal dienen voor op maat gemaakte therapieën voor de patiënt (Personalized Medicine), rekening houdend met het specifieke moleculaire profiel van de tumor van de patiënt.

Deze snelle ontwikkelingen vereisen ook continue aanpassing van de technieken op het moleculaire lab. Daar waar eerder een enkele PCR reactie voldoende was om een mutatie analyse te doen is dit in de afgelopen jaren uitgegroeid tot het analyseren van meerdere exonen van meerdere genen. Met de gangbare moleculaire technieken voor mutatieanalyse kan dit problemen opleveren, omdat uitbreiding van het aantal moleculaire markers betekent dat voor iedere nieuwe marker een extra bepaling moet worden uitgevoerd, waarvoor een deel van het beschikbare patiëntmateriaal nodig is. De hoeveelheid beschikbaar patiëntmateriaal is in vele gevallen echter zeer beperkt en vaak kan uit de tumor relatief weinig DNA worden geïsoleerd. Efficiëntere sequentie analyse technieken zijn daarom nodig om een maximale hoeveelheid informatie uit een minimale hoeveelheid DNA te kunnen halen. Next Generation Sequencing (NGS) is daarvoor de techniek bij uitstek. NGS is een DNA sequentie analyse methode waarbij vele miljoenen korte parallelle sequentie analyses gelijktijdig worden uitgevoerd en biedt de mogelijkheid een groot aantal moleculaire markers (1 tot 100-den) gelijktijdig te analyseren met gebruik van relatief weinig patiëntmateriaal. De DNA sequentie reacties worden uitgevoerd op een DNA sequencing chip ter grootte van een duimnagel.

IonChip

Next Generation Sequencing en Big Data analyse

LabPON is een modern en goed geoutilleerd lab mede doordat het lab de snelle ontwikkelingen in de pathologie op de voet volgt. Eind 2014 heeft LabPON geïnvesteerd in de aanschaf van een Ion Torrent PGM Next Generation Sequencer, zodat met het weinige DNA dat uit het tumorweefsel van de patiënt wordt geïsoleerd een maximaal rendement kan worden gehaald met betrekking tot de mutatieanalyses. Naast dit voordeel is de NGS ook gevoeliger en kan de methode kwalitatieve (de aanwezigheid van een mutatie) en kwantitatieve (amplificatie of verlies van een moleculaire marker) gegevens aanleveren. De voorbewerking van het DNA is complexer en duurt daardoor in vergelijking met voorgaande mutatieanalyse methoden iets langer, wat zich vertaalt in een iets langere doorlooptijd. Desondanks wordt met NGS een gemiddelde snelle doorlooptijd voor mutatieanalyse van 3-4 werkdagen gehaald.

Toepassing van NGS voor de DNA sequentie bepaling levert een berg aan ruwe data op. Voor analyse van deze data maakt LabPON gebruik van gespecialiseerde software (SeqPilot, JSI Medical Systems) waarmee de ruwe data inzichtelijk wordt gemaakt en wordt gefilterd op de aanwezigheid van nucleotide varianten ten opzichte van het humane referentie genoom. De gevonden varianten worden met behulp van de software automatisch vergeleken met gekoppelde internationale databases COSMIC, ClinVar, 1000genomes en dbSNP, waarmee gevonden varianten als benige variant of maligne mutatie kunnen worden geclassificeerd.

Moleculaire diagnostiek met NGS

Na een uitgebreid validatietraject is NGS op het moleculaire lab nu standaard in gebruik genomen voor mutatie analyses bij het longcarcinoom, het colorectaal carcinoom, het glioom en het gemetastaseerd melanoom. De analytische gevoeligheid van NGS is 10% mutant allel frequentie, wat wil zeggen dat er in de coupe (of in een geselecteerd gebied in het tumorweefsel) minimaal 20% tumorcellen aanwezig moeten zijn. De patholoog selecteert op een coupe het tumorgebied dat voor mutatieanalyse in aanmerking komt en schat het tumorpercentage in. De tumorcellen worden door de analisten vervolgens zo selectief mogelijk (microdissectie) uit het aangegeven gebied geïsoleerd. Uit de geïsoleerde tumorcellen wordt het DNA geïsoleerd dat wordt gebruikt voor NGS.

NGS mutatie analyse wordt standaard uitgevoerd met behulp van een genen panel bestaande uit exonen van de volgende markers: EGFR, KRAS, NRAS, HRAS, BRAF, ERBB2/HER2, PIK3CA, IDH1, IDH2, AMELX en AMELY. Per tumor type wordt een geselecteerde analyse van de data gedaan, waarbij alleen voor de moleculaire markers waarvoor een behandeling voor het betreffende type tumor beschikbaar is een mutatieanalyse wordt uitgevoerd. Desgewenst kan op verzoek van de aanvrager een analyse op de overige markers in het panel worden uitgevoerd.

Mutatie analyse van het longcarcinoom

Voor behandelkeuze met EGFR-TKI (zoals erlotinib, gefitinib) wordt standaard een NGS mutatie analyse uitgevoerd op activerende (o.a. deletie exon 19 en p.L858R) en resistentie (o.a. p.T790M) mutaties in exon 18 t/m 21 van EGFR. Daarnaast wordt ook getest op mutaties in KRAS exon 2 (codon 12/13), exon 3 (codon 59/61) en exon 4 (codon 117/146), BRAF exon 15 (codon 600) en exon 20 van ERBB2/HER2.
Indien zich geen mutaties voordoen in EGFR of KRAS dan wordt de aanwezigheid van breuken in ALK en ROS1 gecontroleerd met behulp van FISH. De aanwezigheid van een breuk in ALK of ROS1 wordt beschouwd als een indicatie voor behandeling met een TKI (bijv. crizotinib).

Mutatie analyse van het colorectaal carcinoom

Voor het colorectaal carcinoom wordt een NGS mutatieanalyse uitgevoerd op exonen 2 t/m 4 (codonen 12/13/59/61/117/146) van zowel KRAS als NRAS. Daarnaast wordt standaard getest op exon 15 BRAF (codon 600) mutaties.
Mutaties in KRAS of NRAS zijn een contra-indicatie voor behandeling van gemetastaseerd colorectaal carcinoom met een anti-EGFR targeted therapie (bijv. Panitumumab, Cetuximab).

Mutatie analyse van het melanoom

Voor het melanoom wordt een NGS mutatie analyse uitgevoerd op BRAF, NRAS en HRAS. Patiënten met een gemetastaseerd melanoom positief voor de specifieke BRAF p.V600E mutatie zijn geïndiceerd voor behandeling met BRAF remmer (bijv. Vemurafenib, Dabrafenib). Omdat NRAS mutaties van belang kan zijn bij het bepalen van behandelmogelijkheden bij patiënten met gemetastaseerd melanoom wordt ook de mutatiestatus van NRAS (codonen12/13/59/61/117/146) bepaald.
HRAS wordt als marker toegepast bij het stellen van differentiaal diagnoses van moeilijk te classificeren afwijkende Spitz laesies.

Mutatie analyse van het glioom

Voor het glioom wordt een NGS mutatie analyse uitgevoerd op IDH1, IDH2 en BRAF ter ondersteuning bij het stellen van de differentiaal diagnose. IDH1/2 mutaties komen relatief vaak voor bij laaggradige gliomen en zelden bij het hooggradige glioblastoom. Daarnaast hebben IDH1/2 mutaties een prognostische waarde. Afhankelijk van het type tumor wordt in combinatie met de NGS mutatie analyse ook MGMT methylering analyse en 1p19q chromosomale co-deletie met behulp van FISH bepaald.
Het moleculaire profiel van gliomen wordt steeds belangrijker in de classificatie en daarmee de behandeling van de hersentumor. LabPON zal het NGS mutatie panel voor gliomen dan ook verder gaan uitbreiden om een betere diagnose en behandeling van de patiënt mogelijk te maken.